Summary (English)

Multiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS). It is characterized by myelin loss, peripheral immune cell recruitment into the CNS, axonal damage as well as microglia and astrocyte activation. Recent studies revealed that astrocytes are multi-functional cells in neuronal homeostasis as well as in central nervous system (CNS) disease. Astrocytes display remarkable flexibility and variability of their morphology and biochemical output, participating in both pathogenic and beneficial changes. In many cases, cell morphology and cell function are inseparably intertwined. In MS, activated astrocytes might influence various processes that are critically involved in the formation of inflammatory lesions, such as local glia responses, the breakdown of the Blood Brain Barrier and the recruitment of leukocytes into the CNS. The functional phenotype of activated astrocytes thereby can be either detrimental or protective and is thought to be reflected by morphological changes.

On the molecular level, a key player in the astrocyte-mediated regulation of lesion formation might be the small secreted protein Lipocalin 2 (LCN2). We hypothesize that a sub-population of perivascular astrocytes exits in the brain that responds to (autoimmune-) inflammatory processes by the production and secretion of LCN2, thus potentially modulating local inflammatory responses and the entry of (autoimmune) lymphocytes into the brain.

In this project we will adopt the neuron tracing and reconstruction software “Neurolucida360” to quantify astrocyte morphology, thus implementing “Glialucida360”. Key morphological parameters, among cell volume, process complexity, or astrocyte polarity will be quantified in control and experimental inflammatory demyelination models. For the very first time, we will analyze the consequence of innate and adaptive immunity encounter for astrocyte morphology and function.

To subject astrocytes to different pathological conditions, we will use three distinct injury paradigms which all show CNS demyelination. The very same animal models will be used to analyze the function of LCN2-expressing astrocyte subpopulations for inflammatory lesion development. Besides astrocyte-specific LCN2-/- mice, we will use FAC sorting, flow cytometry, electron microscopy and cell culture approaches to reveal how LCN2 regulates astrocyte function.

Zusammenfassung (deutsch)

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Sie ist gekennzeichnet durch fokale Entmarkung, Rekrutierung peripherer Immunzellen in das ZNS, axonale Schädigung sowie Mikroglia- und Astrozytenaktivierung. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Astrozyten multifunktionale Zellen bei der neuronalen Homöostase sowie bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) sind. Astrozyten weisen eine bemerkenswerte Flexibilität und Variabilität ihrer Morphologie und biochemischen Prozesse auf und sind sowohl an pathogenen als auch an protektiven Vorgängen beteiligt. Zellmorphologie und Zellfunktion sind in vielen Fällen untrennbar miteinander verbunden. Bei MS könnten aktivierte Astrozyten verschiedene Prozesse beeinflussen, die entscheidend an der Bildung entzündlicher Läsionen beteiligt sind, wie z. B. lokale Glia-Reaktionen, die Öffnung der Blut-Hirn-Schranke und die Rekrutierung von Leukozyten in das ZNS. Der funktionelle Phänotyp aktivierter Astrozyten kann dabei entweder schädlich oder protektiv sein und spiegelt sich in morphologischen Veränderungen wider.

Auf molekularer Ebene könnte das kleine sezernierte Protein Lipocalin 2 (LCN2) eine Schlüsselrolle bei der Astrozyten-vermittelten Regulation der Läsionsentstehung spielen. Wir stellen die Hypothese auf, dass eine Subpopulation von perivaskulären Astrozyten im Gehirn existiert, die auf (autoimmun-) entzündliche Prozesse durch die Produktion und Sekretion von LCN2 reagiert und so potenziell lokale Entzündungsreaktionen und den Eintritt von (autoimmunen) Lymphozyten in das Gehirn beeinflusst.

In diesem Projekt werden wir die Neuron-Tracing- und Rekonstruktionssoftware „Neurolucida360“ zur Quantifizierung der Astrozytenmorphologie einsetzen und so „Glialucida360“ implementieren. Wichtige morphologische Parameter wie Zellvolumen, Prozesskomplexität oder Polarität von Astrozyten werden unter Kontrollbedingungen und in experimentellen entzündlichen Demyelinisierungsmodellen quantifiziert. Zum ersten Mal werden wir den Einfluss angeborener und adaptiver Immunreize für die Morphologie und Funktion von Astrozyten analysieren.

Um Astrozyten unterschiedlichen pathologischen Reizen auszusetzen, werden wir drei verschiedene Schädigungsmodelle verwenden, die alle durch eine ZNS-Demyelinisierung charakterisiert sind. Dieselben Tiermodelle werden verwendet werden, um die Rolle von LCN2-exprimierenden Astrozyten-Subpopulationen für die Entwicklung entzündlicher Läsionen zu analysieren. Neben Astrozyten-spezifischen LCN2-/- Mäusen werden wir FACS, Elektronenmikroskopie und Zellkulturansätze verwenden, um aufzuzeigen, wie LCN2 die Astrozytenfunktion reguliert.

Summary (English)

As part of biomedical research, pathological diagnosis, student training and the establishment of new surgical techniques, various organs or entire bodies have to be fixed and, thus, protected from decay. For this purpose, solutions containing formaldehyde have been used for decades. However, due to known carcinogenic and teratogenic effects, formaldehyde-based solutions are questionable in terms of occupational health and safety aspects. It must be assumed that there will be an EU-wide ban in the near future. Research into alternative methods of tissue fixation and conservation in biomedical research, pathology and anatomy is, therefore, urgently needed. The preservation of biological samples with the help of preservatives is also used in the food industry. They are used to protect products against spoilage thanks to their antimicrobial effects. The food preservatives used in Germany are largely considered to be harmless to health and could thus represent a promising alternative to fixatives containing formaldehyde. In preliminary experiments, we were able to demonstrate that lactic acid-based solutions have a broad antimicrobial spectrum and that fixed murine tissue samples can subsequently be used for histochemical and immunohistochemical stains. As part of the project presented here, the fixative effects of food preservatives for use in biomedical research, pathology and anatomy as a substitute for formaldehyde-based fixation will be investigated. Based on our promising preliminary findings, various lactic acid-based solutions will be further investigated with regard to their fixation properties, their antimicrobial spectrum, tissue preservation and the suitability of subsequent histological analyzes. In order to investigate the possible use of lactic acid-based solutions in clinical-anatomical courses, long-term preservative effects, biomechanical tissue properties and color retention will be investigated in murine and human tissues. In addition to these objective analyzes, the quality of fixed corpses of body donors is assessed as part of anatomical advanced training courses. This project, thus, makes an important contribution to the sustainable assurance of research, tissue diagnostics and teaching based on body donations.

Zusammenfassung (Deutsch)

Im Rahmen der Forschung, der pathologischen Befundung, der studentischen Ausbildung und der Etablierung neuer chirurgischer Verfahren müssen verschiedene Organe oder ganze Körper fixiert und so vor Verwesung geschützt werden. Seit Jahrzenten kommen hierbei formaldehydhaltige Fixierlösungen zum Einsatz. Diese sind allerdings, aufgrund bekannter kanzerogener und teratogener Effekte, arbeitsschutzrechtlich bedenklich. Von einem in Kürze eintretendem EU-weitem Verbot muss ausgegangen werden. Die Erforschung alternativer Methoden der Gewebsfixierung und Konservierung in biomedizinischer Forschung, Pathologie und Anatomie ist deswegen dringend notwendig. Das Haltbarmachen biologischer Proben mit Hilfe von Konservierungsstoffen kommt auch in der Lebensmittelindustrie zum Einsatz. Konservierungsstoffe werden verwendet, um Produkte – dank ihrer antimikrobiellen Wirkung – vor Verderb zu schützen. Die in Deutschland verwendeten Substanzen gelten als weitgehend gesundheitlich unbedenklich und könnten so eine vielversprechende Alternative zu formaldehydhaltigen Fixierlösungen darstellen. In Vorversuchen konnten wir nachweisen, dass Milchsäure-basierende Fixierlösungen ein breites antimikrobielles Spektrum aufweisen und damit fixierte murine Gewebeproben für histochemische und immunhistochemische Färbungen verwendet werden können. Im Rahmen des hier vorgelegten Projektantrages soll darauf aufbauend die gewebefixierende Wirkung von Lebensmittelkonservierungsstoffen für den Einsatz in biomedizinischer Forschung, Pathologie und Anatomie als Ersatz für eine Formaldehyd-basierte Fixierung untersucht werden. Ausgehend von unseren vielversprechenden Vorbefunden sollen verschiedene Milchsäure-basierter Fixierlösungen hinsichtlich ihrer Fixierungseigenschaften, ihres antimikrobiellen Spektrums, des Gewebserhalts und der Eignung nachgeschalteter histologischer Analysen weiter untersucht werden. Um darüber hinaus einen möglichen Einsatz Milchsäure-basierter Fixierlösungen in der Anatomie zu untersuchen, werden Langzeiteffekte, biomechanische Gewebeeigenschaften sowie Farberhalt in murinen und humanen Geweben untersucht. Neben diesen objektiven Analysen wird die Qualität fixierter Körperspenden im Rahmen von anatomischen Fort- und Weiterbildungskursen bewertet. Dieses Projekt leistet somit einen wichtigen Beitrag zur nachhaltigen Sicherung von Forschung, Gewebsdiagnostik und Lehre am Präparat.

Zusammenfassung (Deutsch)

Anorexia nervosa (AN), auch Magersucht genannt, ist eine Essstörung, die durch das krankhafte Bedürfnis gekennzeichnet ist, Gewicht zu vermindern. Sie hat die höchste Sterblichkeitsrate von allen psychiatrischen Erkrankungen und betrifft vor allem junge Mädchen und Frauen, immer häufiger erkranken aber auch Jungen und Männer. Wie bei vielen psychiatrischen Erkrankungen sind die Behandlungsmöglichkeiten bei der AN begrenzt. Über zu Grunde liegende zelluläre und molekularbiologische Mechanismen ist wenig bekannt. Neben den Neuronen rücken Astrozyten, und damit verbunden die sogenannte Gliotransmission, also eine Beeinflussung der neuronalen Kommunikation durch Astrozyten, in den Fokus des wissenschaftlichen Interesses.

Mit Hilfe eines Aktivitäts-basierten Anorexie-Modells (ABA), welches Futterrestriktion mit einem Laufradzugang verbindet, können die zellulären Veränderungen im Gehirn bei Starvation untersucht werden. Dieses Modell spiegelt viele der somatischen Aspekte der AN wie Gewichtsverlust, Amenorrhö und Hyperaktivität wieder. Im Rahmen von eigenen Vorarbeiten in Ratten konnten wir erstmalig Gehirnvolumenverluste feststellen, begleitet von einer Reduktion GFAP+ Astrozyten im zerebralen Kortex und Corpus callosum. Zusätzlich wurden Beeinträchtigungen des Wiedererkennungsgedächtnisses festgestellt. Ursachen der Gehirnatrophie und Reduktion der GFAP-Zelldichte sind bisher unbekannt,

Im Rahmen des hier vorgelegten Projektes soll das ABA-Modell von der Ratte in die Spezies Maus übertragen werden, um so funktionelle Analysen mit Mausmutanten zu ermöglichen. Als mögliche zelluläre Ursachen der Reduktion von GFAP-positiven Zelldichten werden eine verminderte Proliferation von Astrozyten-Vorläuferzellen, ein Absterben von Astrozyten, eine Reduktion der Gfap mRNA Expression und eine inhibierte GFAP-Translation analysiert. Insbesondere soll untersucht werden, ob die Induktion einer sogenannten Unfolded protein response (engl., UPR), infolge der experimentellen Starvation, zu einer Verminderung der Proteintranslation führt und so zum Krankheitsbild beiträgt. Potentielle neuronale Veränderungen, insbesondere eine modifizierte Spineanzahl bzw. -morphologie, werden mit Hilfe einer transgenen Mauslinie mit neuronal-spezifischer fluoreszenter Protein-Expression untersucht. Ein weiteres Ziel des Projektes ist zu untersuchen, ob kognitive Teilleistungsstörungen, wie sie bei AN-Patienten häufig auftreten, auch im murinen ABA-Tiermodell nachweisbar sind. Schlussendlich soll durch Wiederauffütterungsversuche untersucht werden, inwiefern die beobachteten Veränderungen sowohl auf zellulärer als auch Verhaltensebene vollständig reversibel sind.

Der vorgelegte Projektantrag leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Pathophysiologie bei AN, insbesondere der Rolle von Gliazellen bei Starvation, und somit einen wertvollen Beitrag zur Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte der AN.

Zusammenfassung (Deutsch)

Die Nebenschilddrüsen (NSD) und ihr wichtigstes endokrines Produkt, das Parathormon (PTH), sind für die Aufrechterhaltung der Mineralstoffhomöostase von wesentlicher Bedeutung. Durch die Freisetzung von PTH steuern die NSD den Kalzium- (Ca) und Phosphorspiegel (P) im Serum, was Einfluss auf die Knochenmineralisierung und die generelle P-Versorgung im Organismus nimmt. Die physiologischen Zusammenhänge gelten für alle Säugetiere, einschließlich großer Tiermodelle wie dem Schwein. Die PTH-Expression, die mRNA-Stabilität und die Hormonsekretion werden durch eine Vielzahl von Effektormolekülen gesteuert, darunter Mineralstoffe, endokrine Faktoren und miRNAs, hängen aber auch von post-transkriptionellen Veränderungen und Proliferations-Signalen ab. In einem Fütterungsversuch mit variablen P-Gehalten an Schweinen konnten darüber hinaus intrazelluläre Signalwege zur Kontrolle der PTH-Expression und Sekretion identifiziert werden.

Jede NSD besteht aus lobulärem Parenchym, das durch extrazelluläres Kollagen strukturiert ist, und zeigt seine höchste Reaktionsfähigkeit auf externe Stimuli als intaktes Gewebe. Schweine wiesen nach einer reduzierten P-Versorgung erhöhte Transkriptmengen verschiedener Kollagene in den NSD auf. Begleitende histologische Vorarbeiten zeigen, dass sich dies auch auf der Proteinebene widerspiegelt und zu einem veränderten Verhältnis zwischen extrazellulärem Kollagen und PTH-produzierendem Parenchym führt.

Für eine genauere Analyse der diätspezifischen NSD-Mikroanatomie sollen in dem Zusammenhang immunhistochemische Färbungen insbesondere gegen die strukturellen Hauptkomponenten der Extrazellularmatrix (u.a. Col1A1, Col1A2 und Col3A1) und fluorophorbasierte Doppelfärbungen gegen PTH und den Hauptregulator für PTH, den calciumsensitiven Rezeptor (CaSR), durchgeführt werden. Auf der Grundlage dieser Etablierung kann in Folgearbeiten untersucht werden, inwieweit das Expressionsmuster der verschiedenen Kollagenarten nach variabler P-Zufuhr mit dem mikroanatomischen Profil im Gewebe übereinstimmt. Der Nachweis der ernährungsassoziierten Kollagenhäufigkeit in den NSD kann zu neuen therapeutischen Strategien zum Erhalt der Mineralstoffhomöostase beitragen.

Die erfolgreiche Etablierung von Antikörpern für die Immunhistochemie wird eine analytische Lücke bei der Bewertung des P-Status und möglicher endogener Mechanismen nach variabler P-Versorgung schließen.